顯微鏡—標本制備和圖像采集

許多用于共聚焦顯微鏡的實驗技術方法，多以普通光學顯微鏡為基礎，必要時進f?改進以適合共日焦顯微鏡的需要。對于普通顯微鏡，主要方法是降低焦點以外的熒光干擾。與普通光學顯微鏡相比，事聚焦顯微鏡可進行厚標本深部的熒光觀察，對標本的染色要求染色的時間較長或熒光探針的濃度較高這對于普通光學顯微鏡可能造成染色過度，而無法分辨其細節(jié)。

典型的LSCM系統(tǒng)，盡管每秒掃撈多點，但其掃描強度大、亮度高。通常每點掃描時間為1。6p5對于每點的平均照明強度相對處于中等水平，比普通熒光顯微鏡低，對組織損傷小：許多實驗技術使只丁抗光源白刑，可防止激光光束對熒光團的光漂白作用。為防止激光對熒光探針的光漂白作用，盡可閉使用zui低強度的激光，現(xiàn)代的高水平LSCM，可以不使用抗光漂白劑。

顯微鏡—標本制備和圖像采集

    LSCM的應用，使得較厚切片的圖像質量得到較大的改善。標本必須*地適合顯微鏡的鏡臺，至觀察的區(qū)域應當在顯微鏡鏡頭的工作距離之內。如高分辨串的60x，NA（數值孔徑）1．4的物鏡其工作距離為170μm；而凹x，NA o．75的物鏡其工作距離可達660μm。為觀察合適的區(qū)域，有時必須以損失分辨率為代價，否則，使用不適當的鏡頭，可能造成標本被壓碎或損傷。

透光性和渾濁度可影響激光束的穿透深度，未固定和末染色的眼角膜上皮相當透明，激光束可穿適深達200μm左友而對于未固定的皮膚組織，其穿透深度僅約為10Pμm，因為它透明度很差．光散射多‘組織的作用就保中密度濾光片，可減弱激光束。在固定過程中加入某些透明刑可增加組織的透明度。

顯微鏡—標本制備和圖像采集

激光能穿透較厚的標本這一問題解決后，可用普通切片機切出較厚的切片，也可用振動切片機制備恬體腑組織切片，在LSCM下，可獲得良好的標記效果。為了觀察標本深部也可將標本從切片取下．佼其顛倒后再貼到切片上進行觀察，從兩個方向觀察標本。也可用長波長激發(fā)的熒光染料，如CY5來標匯標本較深部位的物質，而不用短波長激發(fā)的熒光染料標記。與短波長熒光染料標記的圖像相比，其分辨率略有降低，但卻獲得了較強的穿透力。多光子LSCM，因為采用了紅光作為激發(fā)光，則有利于從標本的深部采集圖像。

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