徠卡熒光顯微鏡是利用特定波長(zhǎng)的光照射被檢物體產(chǎn)生熒光進(jìn)行鏡檢的顯微光學(xué)觀測(cè)技術(shù)，已有100多年歷史。近年來，由于免疫熒光在醫(yī)學(xué)研究、診斷領(lǐng)域里的廣泛應(yīng)用，F(xiàn)ISH、綠色熒光蛋白(GFP)技術(shù)分別在基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)研究方面的推廣，顯微照相、數(shù)字CCD成像技術(shù)的輔助驅(qū)動(dòng)，賦予這一傳統(tǒng)技術(shù)更新的應(yīng)用價(jià)值和生命力。
徠卡熒光顯微鏡的基本原理：
熒光：是一種非溫度輻射冷光，據(jù)發(fā)生性質(zhì)可分為光化熒光(由特定光源光譜激發(fā)而產(chǎn)生的熒光)、放射熒光(放射性物質(zhì)激發(fā))、生物熒光(生物體發(fā)出)、化學(xué)熒光(如磷氧化時(shí))等。
熒光現(xiàn)象：某物質(zhì)在受到某種特定波長(zhǎng)的高能量光(短波長(zhǎng))照射后獲取能量，幾乎即時(shí)(約在10～15s后)其分子內(nèi)的電子躍遷到較高能級(jí)軌道使分子進(jìn)入激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的分子不通過內(nèi)部轉(zhuǎn)換方式消耗能量回到基態(tài)，而是釋放出相應(yīng)較低能量的光量子→人眼可見的熒光(較長(zhǎng)波長(zhǎng))。
熒光現(xiàn)象有兩種：一次熒光現(xiàn)象，又稱“固有熒光”或“自發(fā)熒光”，是指經(jīng)照射后，就能發(fā)出熒光的物質(zhì)，此類物質(zhì)的化學(xué)特征是發(fā)光分子具有共軛雙鍵，π電子活動(dòng)性大。二次熒光現(xiàn)象，又稱“繼發(fā)熒光”，物質(zhì)經(jīng)照射后不能或只能部分發(fā)生微弱的熒光，這樣就需先用熒光色素(或稱熒光染料、熒光探針)標(biāo)記處理，將熒光色素標(biāo)記結(jié)合插入到不發(fā)光的活性分子中去，再經(jīng)照射才能發(fā)生熒光。熒光色素應(yīng)具備的基本條件是能與不發(fā)光分子的某個(gè)區(qū)域有特異性的牢固結(jié)合，同時(shí)不會(huì)影響被結(jié)合分子的結(jié)構(gòu)和特性，光量子效率應(yīng)≥013。
熒光的產(chǎn)生包含了激發(fā)(Excitation)和發(fā)射(Emission)兩個(gè)過程，激發(fā)光譜短于發(fā)射光譜，故光色不同。而不同的熒光物質(zhì)或熒光色素有其最敏感而有效的激發(fā)波長(zhǎng)，因此選擇合適的激發(fā)/發(fā)射光譜以獲得最佳的熒光鏡像質(zhì)量是實(shí)驗(yàn)中要首先考慮的。
熒光顯微鏡是利用“光化熒光”成像，如果所選激發(fā)波長(zhǎng)在肉眼所看不見的近紫外光區(qū)(320～400nm)，熒光的發(fā)射光譜也較普通光鏡光源的平均波長(zhǎng)短，光學(xué)分辨率提高。
