【課堂】 電鏡技術 — 讓病毒無所遁形

2020年，似乎來得更艱難一點。從去年12月份開始，新冠肺炎疫情（COVID-19）就像龍卷風一樣席卷中國乃至*，當前已在100多個國家地區(qū)蔓延，病例數(shù)超10萬。新冠肺炎疫情構成大流行的威脅“已經(jīng)變得非常真實”。

疫情防治防控關鍵階段，總理為什么特意去電鏡室？

2020年2月9日，總理赴中國醫(yī)學科學院病原生物學研究所考察，通過透射電鏡觀察新冠病毒

疫情之下，奔跑在一線的有我們的白衣天使，也有爭分奪秒的科研人員。而在整個疫情的防控防治過程中，電鏡技術，讓病毒無所遁形。

負染色技術—鑒定病毒形態(tài)

為什么是冠狀病毒？

電鏡給了一個很重要的指標：病毒形態(tài)。

1月6日，中國疾控中心通過對臨床患者分離毒株樣品進行電鏡負染色，發(fā)現(xiàn)了病毒的存在，且形狀與冠狀病毒相似，直徑80-120nm，表面有皇冠一樣的突起，這就給我們一個很重要的方向指示。隨后，根據(jù)核酸序列比對以及其他鑒定方法，宣布新型冠狀病毒肺炎疫情爆發(fā)。

負染色技術可以鑒別病毒形態(tài)、純度和濃度。

負染技術流程簡單，檢測速度快。一般幾分鐘就可以完成。

載網(wǎng)要求：

1、 載網(wǎng)親水：商業(yè)化載網(wǎng)表面有油脂，懸液樣品鋪不開

2、 碳膜載網(wǎng)：促進樣品顆粒均勻分布

徠卡高真空鍍膜儀，一機兩用：鍍膜+輝光放電

EM ACE系列鍍膜儀

Leica EM ACE200

負染技術—徠卡解決方案

冷凍電鏡技術—指導藥物和疫苗設計

新冠病毒表面的S蛋白，是侵染宿主的關鍵蛋白，與SARS病毒S蛋白一樣，都將宿主細胞表面的“血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）”作為侵入細胞的關鍵受體。了解S蛋白的結構，弄清楚S蛋白與ACE2的作用方式，是藥物開發(fā)和疫苗設計的重點。

2月15日，德克薩斯大學*分校McLellan團隊獲得了新冠病毒S蛋白三維結構，分辨率達3.5埃，確定了該S蛋白是由S1和S2組成的三聚體。RBD是受體結合區(qū)域，存在多種構象狀態(tài)。與SARS病毒S蛋白比較，兩者是不同的，但整體上仍具有較高的相似度。

隨后，作者又分別分析了兩個病毒S蛋白與ACE2的親和力，新冠病毒S蛋白與ACE2的KD（平衡解離常數(shù)）是14.7nM，SARS病毒S蛋白與ACE2的KD是324.8nM，KD越高，親和力越低，暗示著新冠病毒的傳染性要高于SARS病毒。

3月1日，華盛頓大學David Veesler團隊根據(jù)S蛋白存在多種構象，重構了3.0埃的close構象，以及3.3埃的打開單個SB區(qū)的三聚體。

結果表明，新冠病毒S胞外區(qū)表現(xiàn)為一個16nm長的三聚體，三角形截面，與SARS病毒S蛋白非常相似。很多序列是保守的，設計針對這一結構功能的抗體，可能會交叉反應中和這兩種病毒以及其他相似的冠狀病毒。

同時還發(fā)現(xiàn)S1和S2邊界處存在四個氨基酸殘基插入，從而引入了新的蛋白酶切位點。這就可能會增強病毒的可傳播性，更加科學地解釋了新冠病毒傳染力強的問題。

2月19日，西湖大學周強教授團隊獲得了ACE2的全長三維結構，同時解析了S蛋白RBD和ACE2的復合物三維結構，看清楚了它們的相互作用方式，這一步正式揭開了新冠病毒入侵人體細胞的神秘面紗。

“S蛋白像一座橋橫跨在ACE2表面，又像病毒的一只手，緊緊抓住ACE2，打開細胞大門”。

了解了鎖的結構，接下來，就可以有針對性地設計鑰匙，設計藥物和指導疫苗的研發(fā)。

技術流程與負染類似，但是樣品終要經(jīng)過投入冷凍，在低溫電鏡下進行觀察。

徠卡的EM GP2，就是一款專業(yè)的投入冷凍儀，通過對樣品的單邊或雙邊的平行吸附，實現(xiàn)樣品的快速均勻冷凍。包括生物樣品，工業(yè)溶劑、懸濁液、乳濁液、膠體樣品等。

冷凍電鏡技術—徠卡解決方案

結果展示：

樣品：蛋白

觀察方式：cryo TEM

樣品：病毒

觀察方式：cryo TEM

樣品：纖維

觀察方式：cryo TEM

樣品：細菌

觀察方式：cryo TEM